M. Falchieri, P . A. Brown, E. Catelli, C. J Naylor
Un protocollo standard di RT Nested-PCR ad alta sensibilità viene comunemente usato nei nostri laboratori per evidenziare Metapneumovirus aviare (AMPV) e distinguere i sottotipi A e B (Cavanagh et al., 1999). Tale protocollo prevede, a seguito della fase di retrotrascrizione (RT), due PCR consecutive localizzate a livello del gene che codifica per la proteina di adesione (G). La prima amplificazione, cosiddetta esterna, utilizza primer (G1 + e G6 -) comuni a entrambi i sottotipi, mentre la seconda PCR, o interna, prevede un primer antisenso comune (G5 -) e due primer senso, uno specifico per il sottotipo A (G8+A) e l’altro specifico per il sottotipo B (G9+B). In caso di positività al sottotipo A l’amplificato è di 268 pb mentre al sottotipo B è di 361 pb. Fino ad oggi si è sempre evitato l’impiego di virus come controlli positivi per il rischio di possibili contaminazioni responsabili di falsi positivi.
Questo lavoro descrive l’utilizzo di metodiche di Reverse Genetics per la produzione di un virus geneticamente modificato in grado di generare nella RT Nested PCR standard precedentemente descritta, amplificati di dimensioni maggiori rispetto a quelli generati da virus non modificati. Tale virus, impiegato come controllo positivo, rende possibile evidenziare immediatamente eventuali contaminazioni.
Una copia DNA del genoma di un AMPV sottotipo A è stata modificata tramite Site Direct Mutagenesis al fine di introdurre, a livello del gene G, la sequenza nucleotidica del primer specifico per il sottotipo B (G9+B), nella posizione equivalente.
Per aumentare le dimensioni degli amplificati è stata successivamente introdotta una sequenza esogena fra i siti di attacco delle coppie di primer esterne ed interne della PCR. Il prodotto finale della PCR da DNA modificato ha prodotto amplificati di 463 e 556 pb, per il sottotipo A e B rispettivamente, di dimensioni maggiori rispetto a quelle che si ottengono da virus non modificati (figura 1). Mediante Reverse Genetics (Naylor et al.,2004), è stato quindi generato, da DNA modificato, un virus che dopo estrazione dell’RNA ed RT Nested PCR ha prodotto ugualmente gli amplificati attesi. Successivamente, per convenienza, il virus è stato adsorbito su carta filtro, fatto asciugare e inattivato tramite trattamento con microonde, quindi conservato in provette. L’RNA estratto da tali preparati è stato quindi usato efficacemente come controllo positivo.
