Cecchinato M., Lupini C., Munoz Pogoreltseva O.S., Listorti V., Mondin A., Catelli E.

Il Metapneumovirus aviare (AMPV) è un virus RNA a singolo filamento non segmentato a polarità negativa. Finora sono stati identificati quattro sottotipi di questo virus, A, B, C e D (Gough e Jones, 2008). I primi due sono quelli maggiormente diffusi a livello mondiale e sono gli unici ad essere stati segnalati nel territorio italiano. Il sottotipo B è quello maggiormente diffuso in Italia (Cecchinato et al., 2010), soprattutto nelle zone del Nord, dove vi è una maggiore concentrazione di allevamenti avicoli.
Il virus colpisce diverse specie aviari, particolarmente tacchino e pollo. Nel tacchino causa un’infezione acuta e molto contagiosa del tratto respiratorio superiore, la Rinotracheite del tacchino (TRT). Mentre nel pollo causa una malattia clinica meno evidente e meno grave, sempre che non sia complicata da altri fattori, soprattutto batterici come Escherichia coli (Gough e Jones, 2008). In questi casi sfocia spesso nella Sindrome della Testa Gonfia (SHS). Può causare perdite economiche significative, legate principalmente alle infezioni batteriche secondarie (OIE, 2012a). Sia nel tacchino che nel pollo è in grado anche di provocare cali della ovodeposizione ( Naylor e Jones, 1993; Cecchinato et al., 2012).
La variabilità genomica di AMPV insieme con le manifestazioni cliniche non patognomoniche riportate nelle diverse specie aviari, la sua scarsa capacità di replicazione nell’organismo ospite e la sua capacità di causare infezioni in assenza di sintomatologia clinica evidente (Cook et al., 1988), rendono necessari metodi diagnostici molto sensibili, accurati e affidabili (Cook e Cavanagh, 2002). La biologia molecolare offre un’alternativa veloce, sensibile, pratica e specifica per la diagnosi delle infezioni sostenute da AMPV (OIE, 2009) rispetto alle metodiche classiche. Per questa ragione nel corso degli anni sono stati messi a punto diversi protocolli di RT-PCR per la ricerca di questo virus e negli ultimi anni è stata rivolta particolare attenzione all’applicazione di una variante della PCR convenzionale, la Real-Time PCR. La Real-Time PCR è una tecnica che permette di osservare la cinetica della formazione degli amplificati in tempo reale grazie all’uso di sostanze fluorescenti che si legano, in forma specifica o aspecifica, alla sequenza bersaglio e successivamente emettono un segnale fluorescente che aumenta di intensità con l’aumentare del numero di amplificati sintetizzati. Permette simultaneamente di identificare e quantificare la sequenza bersaglio e non richiede ulteriori passaggi per la visualizzazione dell’amplificato come invece avviene nella PCR, riducendo così i tempi di diagnosi e limitando la manipolazione del campione (Watzinger et al., 2006).
Lo scopo del presente lavoro è stato quello di mettere a punto una Real-Time PCR capace di identificare, discriminare e quantificare AMPV sottotipo A e B. Nella prima fase è stato utilizzato un sistema di quantificazione aspecifico. Sono state testate varie coppie di primer, disegnate sulle sequenze di geni diversi, e scelta la migliore in termini di sensibilità e specificità. Nelle fasi successive il sistema di quantificazione è stato sostituito con sonde sottotipo specifiche. Il protocollo è stato successivamente ottimizzato e messo a confronto con il protocollo di RT nested-PCR per AMPV, attualmente più usato sia in Italia che all’estero, disegnato da  Naylor et al. (1997), testando ceppi virali a titolo noto e campioni da prove sperimentali.