Caroli A., Pugliese N., Camarda A., Legretto M., Marino M., Circella E.
BFDV, Beak and Feather Disease Virus, appartiene alla famiglia Circoviridae e al genere Circovirus (Bassami et al, 1998). A tale genere appartengono virus identiicati in numerose altre specie come il suino, Porcine Circovirus (PCV-1, PCV-2) (Hamel et at, 1998), e virus identiicati nei volatili, nel piccione Pigeon Circovirus (PiCV) (Mankertz et al, 2000), nell’oca Goose Circovirus (GoCV) (Todd et al, 2001b), nel canarino Canary Circovirus (CaCV) (Todd et al, 2001), nell’anatra Duck Circovirus (DuCV) (Todd et al, 2005), nel gabbiano Gull Circovirus (GuCV) (Twentyman et al, 1999), nel Diamante di Gould Finch Circovirus (FiCV) (Shivaprasad et al, 2004), nel corvo australiano Australian raven Circovirus (RaCV) (Stewart et al, 2006), nello storno Starling Circovirus (StCV) (Dayaram et al, 2013), e nel cigno Swan Circovirus (SwCV) (Halami et al, 2008).
BFDV è responsabile nei pappagalli di una la patologia denominata “ Malattia del becco e delle penne” (Psittacine Beak and Feather Disease – PBFD), in virtù della localizzazione tipica delle lesioni riscontrate a livello del becco e delle penne (Gerlach, 1994). La patologia se pur descritta inizialmente in popolazioni di pappagalli selvatici in Australia (Paré et Robert, 2007), attualmente l’infezione è segnalata in tutto il mondo nei pappagalli allevati in cattività a seguito del commercio globale di volatili esotici, ed è stata identiicata in più di 60 specie di psittacidi (Varsani et al, 2011).
Non sempre l’infezione evolve con sintomi speciici evidenti (Circella et al. 2012), ma classicamente la PBFD può manifestarsi in tre diverse forme cliniche, iperacuta, acuta e cronica, in base all’età dei volatili colpiti (Gerlach, 1994). Le lesioni a carico del becco e delle penne appaiono più frequentemente nelle evoluzioni croniche (Todd et Gortazar, 2012). L’infezione è associata ad immunosoppressione che espone i pappagalli all’insorgenza di infezioni secondarie (Todd, 2000).
Le diverse forme con cui la malattia si manifesta sono legate inoltre a numerosi e complessi fattori tra cui la specie colpita, il livello di anticorpi materni, i diversi stipiti coinvolti nell’infezione, la dose infettante e la co-presenza di altri agenti patogeni (de Kloet et de Kloet, 2004).
In questo lavoro sono stati analizzati geneticamente stipiti di circovirus identiicati in pappagalli infetti appartenenti a specie diverse, provenienti da differenti località del centro e sud Italia (tabella 1) ed è stata valutata un’eventuale correlazione tra stipite virale e forma clinica osservata nel soggetto infetto.
Per l’ampliicazione della regione rep sono state allestite due diverse reazioni di PCR, con due differenti coppie di primer, BFDV2/4 (Ypelaar et al., 1999) e DCiVf/r (Todd et al., 2001), che ampliicano due diverse regioni del gene che in parte si sovrappongono. L’intero genoma dei ceppi oggetto di studio è stato ampliicato mediante la tecnica del circolo-rotante (Dean et al., 2001), o mediante primer disegnati sulla base delle regioni conservate del genoma. Per il completamento di tutte le sequenze genomiche secondo la tecnica del cromosome walking, sono stati disegnati e sintetizzati diversi oligonucleotidi.
Le sequenze genomiche ottenute sono state allineate tra loro e con un pannello rappresentativo di genomi di BFDV presenti in GenBank. Il genoma di riferimento di Circovirus del canarino (Todd et al. 2001) è stato utilizzato come radice per le successive analisi ilogenetiche. La dimensione del genoma di tutti i virus identiicati, ampliicati e sequenziati era compresa tra 1.994 pb (IT03) e 2.010 pb (IT213). In tutte le sequenze sono state evidenziate le due ORF, rep e CP. Dall’analisi delle sequenze è emerso che, su tutte, è presente la sequenza altamente conservata TAGTA TTAC, considerata il sito di potenziale origine di replicazione del genoma virale (V arsani et al., 2011), e che alcuni stipiti condividevano altre sequenze ripetute ed invertite soprattutto a monte e a valle dei due geni rep e CP. La struttura di tali regioni ripetute invertite ha i requisiti per originare delle strutture secondarie, pertanto è altamente probabile che si formi una struttura Steam and loop in queste regioni. I ceppi di BFDV nel complesso mostravano una distanza media, in percentuale di posizioni nucleotiche, del 5,9%. Nel particolare è possibile identiicare una sostanziale identità tra i virus identiicati nei cenerini, ad eccezione di mIT60 che mostrava un’identità più elevata con IT24 identiicato nel cacatua. Tale dato risulta molto interessante considerato che i due virus, strettamente correlati ilogeneticamente, venivano identiicati in due volatili appartenenti a due famiglie differenti, Cacatuidae e Psittacidae. Inine i ceppi IT05 e IT06 mostravano un’identità del 100% derivando da due inseparabili che condividevano la stessa gabbia. In base alle percentuali di divergenza nucleotitica (Varsani et al., 2011), è possibile individuare tre diversi ceppi: a (IT05 ed IT06, b comprendente tre varianti: b1 (IT02 ed IT213), b2 (IT24 ed IT60) e b3 (IT30, IT32, IT47 ed IT54), e c (IT03).
Le sequenze genomiche dei virus identiicati sono state comparate con un pannello scelto tra quelle presenti in GenBank. È interessante osservare che i virus riscontrati nei cenerini della variante B3 mostravano un’identità superiore al 98%, con una serie di virus identiicati in Portogallo in cenerini e altri psittaciformi, che ugualmente avevano manifestato un’evoluzione acuta della malattia (Henriques et al., 2010). Dall’analisi dell’albero ilogenetico emerge una parziale speciicità d’ospite di BFDV, dato che alcune varianti sembrano prediligere specie ben precise, anche se le stesse varianti sono state poi identiicate in ospiti di specie piuttosto distanti tra loro. Ad esempio sequenze corrispondenti ad IT03 (identiicato nella cocorita) sono state riscontrate prevalentemente nelle cocorite, ma sono state riportate anche in un cacatua se pur in condizioni di forte promiscuità di specie. Complessivamente l’analisi ilogenetica condotta su un pannello più ampio di virus chiarisce alcuni aspetti critici, come le relazioni clonali tra i ceppi, ma sembra indicare una scarsa specie-speciicità d’ospite, in quanto virus identiicati da specie di pappagalli distanti tra loro entrano a far parte degli stessi clade.
Tuttavia, va considerato che i valori di bootstrap sono piuttosto bassi e quindi le relazioni ilogenetiche tra i virus possono variare notevolmente a seconda della regione genomica di riferimento. Sono state condotte analisi aggiuntive, per chiarire alcuni aspetti delle relazioni ilogenetiche tra gli stipiti oggetto di studio, considerando singolarmente le sequenze dei geni rep e CP e valutando i possibili eventi ricombinativi. Da queste analisi emerge che i ceppi A e B1 abbiano avuto origine da un ancestore comune e che successivamente un evento di ricombinazione che ha coinvolto il gene rep, li abbia separati. Pertanto, la variante b1 può essere riclassiicata come variante A2 del ceppo A. Alla luce di tutte le analisi condotte, i virus analizzati si possono riclassiicare come: ceppo A, variante A1 (IT05 ed IT06); ceppo A, variante A2 (IT02 ed IT213); ceppo B, variante B1 (IT24, IT60 e IT82); ceppo B, variante B2 (IT30, IT32, IT47 e IT54) e ceppo C (IT03).
In conclusione, dalle analisi ilogenetiche si può evincere che sicuramente esiste una certa predisposizione d’ospite di BFDV, ma non è esclusa la possibilità di un passaggio dello stesso stipite ad altre specie, soprattutto in condizioni di forte promiscuità e di contatto ravvicinato. Tali condizioni renderebbero possibile sia l’adattamento di un ceppo a più ospiti, sia la possibilità di coinfezioni nello stesso animale da parte di stipiti diversi, condizione favorevole per l’instaurarsi di eventi di ricombinazione che hanno un ruolo di fondamentale importanza nell’evoluzione di BFDV.
Pertanto per il controllo dell’infezione diventa fondamentale non solo applicare piani di controllo igienico-sanitario, ma anche evitare la stretta promiscuità di specie differenti.
