Mescolini G., Baigent S.J., Catelli E., Nair V.K.
Il virus della malattia di Marek sierotipo 1 (MDV-1 o Gallid alphaherpesvirus 2), un herpesvirus appartenente al genere Mardivirus, è l’agente eziologico della malattia di Marek (MD), una malattia neoplastica a carattere linfoproliferativo del pollo. Il controllo della MD in campo avicolo è basato sulla vaccinazione con ceppi attenuati di MDV-1, come il ceppo CVI988/Rispens, o con ceppi appartenenti allo stesso genere tassonomico ma a due specie virali diverse quali il Gallid alphahervirus 3 o virus della malattia di Marek sierotipo 2 (MDV-2) ed il Meleagrid alphaherpesvirus 1 o herpesvirus del tacchino (HVT). Nessun vaccino ad oggi disponibile per la prevenzione della MD è in grado di impedire l’infezione con ceppi di campo di MDV-1 e la conseguente replicazione ed eliminazione virale: coinfezioni con virus vaccinale e virus di campo sono frequenti negli allevamenti in cui viene applicata la vaccinazione. Di conseguenza è importante poter differenziare i ceppi di campo di MDV-1 dai ceppi vaccinali per potere: (1) confermare il sospetto diagnostico di MD in presenza di sintomatologia clinica o lesioni, (2) monitorare la presenza di ceppi di campo in assenza di sintomatologia clinica o lesioni e (3) confermare il successo vaccinale mediante rilevazione dei virus vaccinali inclusi nel protocollo vaccinale. Mentre la differenziazione fra MDV-1, MDV-2 e HVT risulta semplice per la presenza di geni unici nel genoma di MDV-1 che non trovano omologhi nelle altre due specie virali, la differenziazione tra i ceppi di campo MDV-1 e il ceppo vaccinale CVI988/Rispens risulta essere molto più difficoltosa poiché appartengono alla stessa specie virale e l’organizzazione genomica è totalmente sovrapponibile. Nel corso degli anni sono stati messi a punto svariati test di biologia molecolare (end-point PCR o real-time PCR) per rilevare e differenziare i genomi di MDV-1, MDV-2 e HVT (Handberg et al., 2001; Walkden-Brown et al., 2003; Baigent et al., 2005; Islam et al., 2006; Renz et al., 2006; Cortes et al., 2011). Il numero di metodiche in grado di differenziare i ceppi MDV-1 non vaccinali dai ceppi vaccinali appartenenti alla stessa specie virale (e.g. CVI988/Rispens) è molto più limitato (Gimeno et al. 2014; Baigent et al., 2016, Davidson et al., 2017). Le metodiche di PCR end-point o di real-time PCR sono le più utilizzate per la diagnosi di laboratorio della MD, esse però non sono adatte all’utilizzo in campo in quanto devono essere eseguite da personale formato ed in laboratori attrezzati con apparecchiature dedicate come i termociclatori. La loop-mediated isothermal amplification (LAMP) (Notomi et al., 2000; Nagamine et al., 2002) è una metodica molecolare rapida, specifica, sensibile e di semplice impiego che può superare i limiti delle metodiche molecolari tradizionali (PCR). La LAMP si avvale di una DNA polimerasi con attività di dislocazione del filamento dell’acido nucleico che permette, in condizioni isotermiche di temperatura ed in combinazione con set di oligonucleotidi appositamente disegnati, l’amplificazione esponenziale della sequenza del DNA target sotto forma di ripetizioni concatenate. Essa non richiede l’impiego di apparecchiature sofisticate ma di bagni o blocchi termostati impostati ad una temperatura costante (60-65°C). La metodica LAMP ha una grande specificità intrinseca derivante dall’impiego di un set di sei primer (FIP, BIP, F3, B3, LF, LB) che si appaiano ad otto regioni genomiche della sequenza nucleotidica scelta come target. Esistono diversi metodi per la visualizzazione dei risultati di una amplificazione LAMP (Becherer et al., 2020). Uno dei più diffusi, per il basso costo, la maneggevolezza e la facilità di lettura e di interpretazione del risultato (visualizzazione di linee colorate), prevede l’utilizzo di strip per test immunocromatografici rapidi o dispositivi a flusso laterale (LFD) (Wong et al., 2018). Sono state pubblicate in precedenza alcune metodiche LAMP specie-specifiche in grado di identificare il gene meq o U(L)49 di MDV-1, il gene U(L)50 di MDV-2 o il gene HVT070 di HVT (Angamuthu et al., 2012; Wei et al., 2012; Woźniakowski et al., 2013; Woźniakowski e Niczyporuk, 2015). Il risultato veniva letto attraverso la visualizzazione di un prodotto fluorescente sotto transilluminatori UV grazie all’aggiunta di SYBR green all’amplificato LAMP, oppure attraverso la visualizzazione sotto transilluminatori UV della corsa elettroforetica in gel di agarosio del prodotto LAMP, simile a quella di un ladder.
L’obiettivo del presente studio è stato quello di migliorare le caratteristiche delle metodiche LAMP già esistenti (MDV-1, MDV-2 e HVT) in modo da semplificare la lettura del risultato mediante l’impiego di LFD che velocizzano ulteriormente le tempistiche di analisi e non richiedono l’impiego di termociclatori o transilluminatori. Essendo nota l’elevata tolleranza agli inibitori della metodica LAMP (Francois et al. 2011), le metodiche sopracitate sono state testate su campioni di organi, penne e polveri sottoposti a trattamento termico e centrifugazione, bypassando l’estrazione del DNA genomico con kit commerciali. Sono infine stati messi a punto e validati due nuovi protocolli LAMP con approccio DIVA (Differentiating Infected from Vaccinated Animals) in grado di differenziare fra loro il vaccino HVT ricombinante Vaxxitek® ed il vaccino CVI988/Rispens e di distinguerli dai ceppi di campo MDV-1 non vaccinali.
