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Salmonella spp. rappresenta una delle maggiori cause di tossinfezioni trasmesse da alimenti. Poichè le tecniche colturali convenzionali richiedono lunghi tempi di risposta, negli ultimi anni sono stati sviluppati alcuni metodi PCR notevolmante più rapidi. Lo scopo di questo lavoro è stato quello di ottimizzare un metodo PCR tradizionale per la ricerca di Salmonella spp. da mangimi ad uso zootecnico. T re diversi metodi di estrazione sono stati accoppiati ad un protocollo di amplificazione e testati su mangimi artificialmente contaminati. Utilizzando questo metodo è stato possible rilevare la presenza di 4 u.f.c. Salmonella spp. per 50 grammi di mangime. Gli stessi metodi saranno anche testati su mangimi naturalmente contaminati e su campioni di contenuto cecale di polli SPF sperimentalmente infettati con un ceppo di campo di S. enterica serotype Hadar.

Il Metapneumovirus aviare (AMPV) è l’agente eziologico della Rinotracheite del Tacchino ed è responsabile nel pollo, oltre che d’infezioni respiratorie, di cali dell’ovodeposizione nei riproduttori e nelle ovaiole per la produzione di uova da consumo (Cook et al., 2000; Hess et al., 2004; Sugiyama et al., 2006). In Italia l’infezione è endemica nelle regioni a maggior vocazione avicola quali Lombardia, Veneto ed Emilia Romagna (Catelli et al., 2004). Se il quadro epidemiologico della diffusione di AMPV nell’allevamento del tacchino e del pollo da carne in Italia è piuttosto chiaro, e ben conosciute sono le problematiche sanitarie correlate ad esso (Catelli, 2006), scarse e frammentarie risultano le informazioni relative all’impatto che tale infezione ha sul settore della produzione di uova da consumo.
Allo scopo di delineare un quadro della situazione di campo il più possibile aderente alla realtà, e sulla base di questo sviluppare adeguati piani profilattici, è stata svolta sul territorio nazionale, in particolare nelle aree a rischio d’infezione, un’indagine sulla diffusione di AMPV nell’allevamento della gallina ovaiola. Il progetto ha previsto studi longitudinali e campionamenti singoli in allevamenti sia in fase pollastra che ovaiola, per la ricerca di AMPV diretta, mediante RT-PCR, ed indiretta mediante test ELISA. Dove possibile i risultati sono stati integrati con i dati produttivi dell’allevamento, gli eventuali piani vaccinali applicati e cali dell’ovo deposizione.

Il Metapneumovirus Aviare (AMPV) è un virus a RNA appartenente alla famiglia Paramyxoviridae, genere Metapneumovirus, in grado di determinare infezioni delle prime vie respiratorie nel tacchino e nel pollo. Il confronto delle sequenze nucleotidiche ha permesso di distinguere 4 sottotipi virali (A, B, C e D) (Cook, 2000). Indagini epidemiologiche di campo svolte in Italia hanno evidenziato una netta prevalenza del sottotipo B sin dalla prima comparsa dell’infezioni nel 1987. Per il controllo di AMPV , nel nostro Paese, a partire dagli anni ’90, è stato introdotta la vaccinazione; eseguita prevalentemente col sottotipo B ed in misura minore col sottotipo A, sebbene, sino al 2003, non ci fossero evidenze della presenza di AMPV/A in Italia (Catelli et al., 2004).
I vaccini vivi attenuati conferiscono una buona protezione ma la loro instabilità può portarli a riacquisire virulenza anche dopo un limitato numero di retropassaggi. Sperimentalmente è stato dimostrato che sono sufficienti 4-10 retropassaggi su animali sensibili (Naylor et al. 1994). Uno studio successivo ha dimostrato come ciò può avvenire anche in allevamento. Animali vaccinati al primo giorno di vita in incubatoio con un sottotipo A hanno mostrato, dopo 3 settimane, una forma respiratoria durante la quale è stato isolato un AMPV sottotipo A. Il sequenziamento dell’intero genoma virale e l’identificazione di 9 nucleotidi marker vaccinali ne ha dimostrato l’inequivocabile origine vaccinale (Catelli et al., 2006).
In questo lavoro viene riportato un focolaio di TRT verificatosi in Italia nel 2003, dovuto ad AMPV sottotipo A di origine vaccinale che ha interessato tacchini di 7 settimane vaccinati con un sottotipo B.

Si descrivono i risultati di una prova infezione sperimentale con un ceppo di Salmonella hadar, isolato dal campo, in polli SPF, ed il controllo della replicazione ed escrezione batterica in seguito all’utilizzo di un prodotto, a base di acidi organici ed aromi naturalidentici microincapsulati, miscelato nell’alimento in concentrazioni diverse di 0,3-1.0-5,0 Kg/tonn di mangime. Per una maggior valutazione della prova sono stati raccolti anche i parametri zootecnici.

Si descrive un episodio di infezione da Mycoplasma gallisepticum in polli da riproduzione e i rilessi di natura sanitaria sulla progenie. Considerazioni sugli strumenti diagnostici di laboratorio.

Metapneumovirus aviare (AMPV) è causa nel tacchino di una delle principali patologie di questa specie nota come Rinotracheite del T acchino (TRT). Negli ultimi anni è stato messo a punto un sistema di reverse genetics per AMPV (Naylor et al., 2004), che permette di introdurre mutazioni in punti specifiche del genoma, di ottenere cloni virali infettivi modificati e di valutarne le conseguenze fenotipiche (Naylor et al., 2004). Questo sistema di reverse genetics è stato utilizzato per ottenere un virus ricombinante incapace di esprimere il gene SH che ha portato alla produzione su cellule Vero di un effetto citopatico anomalo caratterizzato da sincizi giganti (Naylor et al., 2004; Ling et al., 2008). La ragione di tale fenomeno potrebbe risiedere nel cambiamento nel pattern di trascrizione genomica dovuto alla perdita di un’unità trascrizionale. Allo scopo di approfondire tale ipotesi, in questo lavoro, il gene SH è stato sostituito con il gene che codifica per la Green Fluorescent Protein (GFP) che ha lunghezza simile e la cui espressione può essere facilmente evidenziata al microscopio ai raggi UV per via della fluorescenza del suo prodotto.

La Malattia di Newcastle (ND), sostenuta dai ceppi patogeni di Paramyxovirus 1, è ritenuta una delle più temibili forme infettive dei volatili per la sua gravità e trasmissibilità; in specie quali il pollo può causare mortalità fino al 100%. Assieme alle norme di profilassi diretta, la vaccinazione è punto cardine del controllo della malattia.
L’infezione da Metapneumovirus aviare (AMPV) causa la Rinotracheite infettiva del tacchino ed è fra le cause, assieme ad Escherichia coli, della Sindrome della testa gonfia nel pollo. Anche per la profilassi di quest’infezione, ampiamente diffusa nel nostro Paese, la vaccinazione è strumento imprescindibile che, anche nel pollo, sta assumendo grande rilevanza.
Poiché, per entrambi i virus, la vaccinazione viene consigliata nelle prime settimane di vita mediante vaccino vivo, di particolare interesse pratico risulterebbe poter associare questi interventi. In tale evenienza risultano necessarie informazioni sulla compatibilità fra i virus vaccinali. Infatti, quando si associano vaccini vivi diversi è fondamentale assicurarsi che non vi siano interferenze negative fra essi, tali da compromettere l’efficacia delle vaccinazioni o addirittura causare effetti patologici indesiderati.
L’obiettivo del presente lavoro è stato appunto quello di valutare l’interferenza fra ceppi vaccinali di NDV e AMPV somministrati in polli Specific Pathogen Free (SPF) singolarmente o in associazione. La ricerca è stata svolta mediante prove sperimentali condotte in condizioni di isolamento biologico e sono stati usati come indicatori la persistenza dei virus vaccinali nell’ospite, la risposta immunitaria e la protezione dalla forma clinica e dalla replicazione virale dopo infezione di prova.

Un protocollo standard di RT Nested-PCR ad alta sensibilità viene comunemente usato nei nostri laboratori per evidenziare Metapneumovirus aviare (AMPV) e distinguere i sottotipi A e B (Cavanagh et al., 1999). Tale protocollo prevede, a seguito della fase di retrotrascrizione (RT), due PCR consecutive localizzate a livello del gene che codifica per la proteina di adesione (G). La prima amplificazione, cosiddetta esterna, utilizza primer (G1 + e G6 -) comuni a entrambi i sottotipi, mentre la seconda PCR, o interna, prevede un primer antisenso comune (G5 -) e due primer senso, uno specifico per il sottotipo A (G8+A) e l’altro specifico per il sottotipo B (G9+B). In caso di positività al sottotipo A l’amplificato è di 268 pb mentre al sottotipo B è di 361 pb. Fino ad oggi si è sempre evitato l’impiego di virus come controlli positivi per il rischio di possibili contaminazioni responsabili di falsi positivi.
Questo lavoro descrive l’utilizzo di metodiche di Reverse Genetics per la produzione di un virus geneticamente modificato in grado di generare nella RT Nested PCR standard precedentemente descritta, amplificati di dimensioni maggiori rispetto a quelli generati da virus non modificati. Tale virus, impiegato come controllo positivo, rende possibile evidenziare immediatamente eventuali contaminazioni.
Una copia DNA del genoma di un AMPV sottotipo A è stata modificata tramite Site Direct Mutagenesis al fine di introdurre, a livello del gene G, la sequenza nucleotidica del primer specifico per il sottotipo B (G9+B), nella posizione equivalente.
Per aumentare le dimensioni degli amplificati è stata successivamente introdotta una sequenza esogena fra i siti di attacco delle coppie di primer esterne ed interne della PCR. Il prodotto finale della PCR da DNA modificato ha prodotto amplificati di 463 e 556 pb, per il sottotipo A e B rispettivamente, di dimensioni maggiori rispetto a quelle che si ottengono da virus non modificati (figura 1). Mediante Reverse Genetics (Naylor et al.,2004), è stato quindi generato, da DNA modificato, un virus che dopo estrazione dell’RNA ed RT Nested PCR ha prodotto ugualmente gli amplificati attesi. Successivamente, per convenienza, il virus è stato adsorbito su carta filtro, fatto asciugare e inattivato tramite trattamento con microonde, quindi conservato in provette. L’RNA estratto da tali preparati è stato quindi usato efficacemente come controllo positivo.

Metapneumovirus aviare (AMPV) è responsabile della Rinotracheite del Tacchino (TRT), e causa importanti perdite economiche in animali non vaccinati. Sono stati sino ad ora identificati, in base alle sequenze nucleotidiche, quattro sottotipi virali denominati A,B,C e D. Alla fine degli anni ’80 sono stati messi in commercio vaccini vivi attenuati largamente impiegati per il controllo di tali infezioni. T uttavia in campo si osservano ancora forme respiratorie dovute da AMPV. Varie ragioni sono state addotte a spiegazione dell’occorrenza di tali focolai tra cui vaccinazione eseguita male, scarsa durata dell’immunità e incompleta protezione tra i sottotipi (Naylor et al., 1997; Van de Zande et al., 2000) o riacquisizione di patogenicità del vaccino stesso (Catelli et al., 2006). Ciò nonostante tali cause non spiegano esaurientemente il verificarsi di focolai di TRT in animali vaccinati correttamente e con vaccino appartenente al medesimo sottotipo virale causa del focolaio.
Dati epidemiologici sulla prevalenza di AMPV in allevamenti di tacchini da carne del Nord Italia hanno messo in evidenza come, dopo l’introduzione della vaccinazione di massa, il numero di positività per AMPV sia complessivamente diminuito negli anni in concomitanza con un aumento del numero di positività osservate in età avanzata (43-90 giorni di età), in gruppi vaccinati col medesimo sottotipo (Catelli, 2006). Il successivo sequenziamento completo del gene di adesione (G) di alcuni isolati responsabili di focolai tardivi in gruppi vaccinati, ha permesso di distinguerli nettamente dal ceppo vaccinale e da tutti i ceppi di AMPV italiani isolati prima del 2001 (Cecchinato et al., 2007).
Allo scopo di determinare se le mutazioni osservate nei ceppi “più recenti” siano state sufficienti al virus per eludere l’immunità vaccinale è stata eseguita un’infezione sperimentale in tacchini vaccinati, inoculandoli con un ceppo isolato nel 2004 o con un ceppo del 1987, e valutando la protezione mediante misurazione della sintomatologia clinica e dell’eliminazione virale.

In questa ricerca 101 stipiti E. coli isolati da broilers, galline ovaiole e tacchini morti per colibacillosi e provenienti da allevamenti e rurali dell’Albania sono stati testati per valutare la sensibilità nei confronti di 12 differenti antibiotici.
Un livello di resistenza elevato è stato riscontrato in particolare nei confronti di E (100 %) AMX (99, 1 %), TE 30 (96,07 %), STR (93,07 %) and N30 (85,15 %). Anche i fluorochinoloni (ENR, CIP5, MAR), si sono rivelati spesso inefficaci in vitro. Inoltre, il 73,33% dei ceppi resistenti ad almeno un chinolone manifestava resistenza anche nei confronti degli altri due testati.
Non sono state riscontrate sostanziali differenze tra i ceppi provenienti dagli allevamenti intensivi e quelli rurali. Resistenze multiple sono state osservate in tutti gli E. coli testati. Rispettivamente, il 23,63 % ed il 17,39% dei ceppi provenienti dagli allevamenti intensivi e rurali sono risultati resistenti a tutte le molecole testate. Questi dati fanno ritenere che in Albania sussista un uso poco accorto degli antibiotici negli allevamenti di pollame che riduce l’efficacia delle terapie nei confronti di E. coli ed amplifica rischio di immettere sul mercato prodotti con residui di farmaci.