18 Settembre 2009
2009 – ASSOCIAZIONE FRA VACCINI VIVI ATTENUATI NELLA PROFILASSI DELLA MALATTIA DI NEWCASTLE E DELL’INFEZIONE DA METAPNEUMOVIRUS AVIARE NEL POLLO
La Malattia di Newcastle (ND), sostenuta dai ceppi patogeni di Paramyxovirus 1, è ritenuta una delle più temibili forme infettive dei volatili per la sua gravità e trasmissibilità; in specie quali il pollo può causare mortalità fino al 100%. Assieme alle norme di profilassi diretta, la vaccinazione è punto cardine del controllo della malattia.
L’infezione da Metapneumovirus aviare (AMPV) causa la Rinotracheite infettiva del tacchino ed è fra le cause, assieme ad Escherichia coli, della Sindrome della testa gonfia nel pollo. Anche per la profilassi di quest’infezione, ampiamente diffusa nel nostro Paese, la vaccinazione è strumento imprescindibile che, anche nel pollo, sta assumendo grande rilevanza.
Poiché, per entrambi i virus, la vaccinazione viene consigliata nelle prime settimane di vita mediante vaccino vivo, di particolare interesse pratico risulterebbe poter associare questi interventi. In tale evenienza risultano necessarie informazioni sulla compatibilità fra i virus vaccinali. Infatti, quando si associano vaccini vivi diversi è fondamentale assicurarsi che non vi siano interferenze negative fra essi, tali da compromettere l’efficacia delle vaccinazioni o addirittura causare effetti patologici indesiderati.
L’obiettivo del presente lavoro è stato appunto quello di valutare l’interferenza fra ceppi vaccinali di NDV e AMPV somministrati in polli Specific Pathogen Free (SPF) singolarmente o in associazione. La ricerca è stata svolta mediante prove sperimentali condotte in condizioni di isolamento biologico e sono stati usati come indicatori la persistenza dei virus vaccinali nell’ospite, la risposta immunitaria e la protezione dalla forma clinica e dalla replicazione virale dopo infezione di prova.
18 Settembre 2009
2009 – UTILIZZO DI REVERSE GENETICS PER LA MESSA A PUNTO DI UN CONTROLLO POSITIVO PER LA RILEVAZIONE E DISTINZIONE, MEDIANTE RT NESTED PCR, DI METAPNEUMOVIRUS AVIARE SOTTOTIPO A E B.
Un protocollo standard di RT Nested-PCR ad alta sensibilità viene comunemente usato nei nostri laboratori per evidenziare Metapneumovirus aviare (AMPV) e distinguere i sottotipi A e B (Cavanagh et al., 1999). Tale protocollo prevede, a seguito della fase di retrotrascrizione (RT), due PCR consecutive localizzate a livello del gene che codifica per la proteina di adesione (G). La prima amplificazione, cosiddetta esterna, utilizza primer (G1 + e G6 -) comuni a entrambi i sottotipi, mentre la seconda PCR, o interna, prevede un primer antisenso comune (G5 -) e due primer senso, uno specifico per il sottotipo A (G8+A) e l’altro specifico per il sottotipo B (G9+B). In caso di positività al sottotipo A l’amplificato è di 268 pb mentre al sottotipo B è di 361 pb. Fino ad oggi si è sempre evitato l’impiego di virus come controlli positivi per il rischio di possibili contaminazioni responsabili di falsi positivi.
Questo lavoro descrive l’utilizzo di metodiche di Reverse Genetics per la produzione di un virus geneticamente modificato in grado di generare nella RT Nested PCR standard precedentemente descritta, amplificati di dimensioni maggiori rispetto a quelli generati da virus non modificati. Tale virus, impiegato come controllo positivo, rende possibile evidenziare immediatamente eventuali contaminazioni.
Una copia DNA del genoma di un AMPV sottotipo A è stata modificata tramite Site Direct Mutagenesis al fine di introdurre, a livello del gene G, la sequenza nucleotidica del primer specifico per il sottotipo B (G9+B), nella posizione equivalente.
Per aumentare le dimensioni degli amplificati è stata successivamente introdotta una sequenza esogena fra i siti di attacco delle coppie di primer esterne ed interne della PCR. Il prodotto finale della PCR da DNA modificato ha prodotto amplificati di 463 e 556 pb, per il sottotipo A e B rispettivamente, di dimensioni maggiori rispetto a quelle che si ottengono da virus non modificati (figura 1). Mediante Reverse Genetics (Naylor et al.,2004), è stato quindi generato, da DNA modificato, un virus che dopo estrazione dell’RNA ed RT Nested PCR ha prodotto ugualmente gli amplificati attesi. Successivamente, per convenienza, il virus è stato adsorbito su carta filtro, fatto asciugare e inattivato tramite trattamento con microonde, quindi conservato in provette. L’RNA estratto da tali preparati è stato quindi usato efficacemente come controllo positivo.
18 Settembre 2009
2009 – EVOLUZIONE ANTIGENICA DI METAPNEUMOVIRUS AVIARE
Metapneumovirus aviare (AMPV) è responsabile della Rinotracheite del Tacchino (TRT), e causa importanti perdite economiche in animali non vaccinati. Sono stati sino ad ora identificati, in base alle sequenze nucleotidiche, quattro sottotipi virali denominati A,B,C e D. Alla fine degli anni ’80 sono stati messi in commercio vaccini vivi attenuati largamente impiegati per il controllo di tali infezioni. T uttavia in campo si osservano ancora forme respiratorie dovute da AMPV. Varie ragioni sono state addotte a spiegazione dell’occorrenza di tali focolai tra cui vaccinazione eseguita male, scarsa durata dell’immunità e incompleta protezione tra i sottotipi (Naylor et al., 1997; Van de Zande et al., 2000) o riacquisizione di patogenicità del vaccino stesso (Catelli et al., 2006). Ciò nonostante tali cause non spiegano esaurientemente il verificarsi di focolai di TRT in animali vaccinati correttamente e con vaccino appartenente al medesimo sottotipo virale causa del focolaio.
Dati epidemiologici sulla prevalenza di AMPV in allevamenti di tacchini da carne del Nord Italia hanno messo in evidenza come, dopo l’introduzione della vaccinazione di massa, il numero di positività per AMPV sia complessivamente diminuito negli anni in concomitanza con un aumento del numero di positività osservate in età avanzata (43-90 giorni di età), in gruppi vaccinati col medesimo sottotipo (Catelli, 2006). Il successivo sequenziamento completo del gene di adesione (G) di alcuni isolati responsabili di focolai tardivi in gruppi vaccinati, ha permesso di distinguerli nettamente dal ceppo vaccinale e da tutti i ceppi di AMPV italiani isolati prima del 2001 (Cecchinato et al., 2007).
Allo scopo di determinare se le mutazioni osservate nei ceppi “più recenti” siano state sufficienti al virus per eludere l’immunità vaccinale è stata eseguita un’infezione sperimentale in tacchini vaccinati, inoculandoli con un ceppo isolato nel 2004 o con un ceppo del 1987, e valutando la protezione mediante misurazione della sintomatologia clinica e dell’eliminazione virale.
18 Settembre 2009
2009 – ANTIMICROBIAL MULTIPLE RESISTANCE OF AVIAN ESCHERICHIA COLI IN ALBANIA
In questa ricerca 101 stipiti E. coli isolati da broilers, galline ovaiole e tacchini morti per colibacillosi e provenienti da allevamenti e rurali dell’Albania sono stati testati per valutare la sensibilità nei confronti di 12 differenti antibiotici.
Un livello di resistenza elevato è stato riscontrato in particolare nei confronti di E (100 %) AMX (99, 1 %), TE 30 (96,07 %), STR (93,07 %) and N30 (85,15 %). Anche i fluorochinoloni (ENR, CIP5, MAR), si sono rivelati spesso inefficaci in vitro. Inoltre, il 73,33% dei ceppi resistenti ad almeno un chinolone manifestava resistenza anche nei confronti degli altri due testati.
Non sono state riscontrate sostanziali differenze tra i ceppi provenienti dagli allevamenti intensivi e quelli rurali. Resistenze multiple sono state osservate in tutti gli E. coli testati. Rispettivamente, il 23,63 % ed il 17,39% dei ceppi provenienti dagli allevamenti intensivi e rurali sono risultati resistenti a tutte le molecole testate. Questi dati fanno ritenere che in Albania sussista un uso poco accorto degli antibiotici negli allevamenti di pollame che riduce l’efficacia delle terapie nei confronti di E. coli ed amplifica rischio di immettere sul mercato prodotti con residui di farmaci.
18 Settembre 2009
2009 – PATHOGENICITY MARKERS OF CLOSTRIDIUM SPP. IN COMMERCIAL TURKEYS.
In seguito al bando europeo degli antibiotici promotori della crescita, le enteriti di differente eziologia (virus, batteri, protozoi) stanno diventando la principale causa di perdita economica nell’allevamento del tacchino commerciale. Lo scopo del presente lavoro è la tipizzazione di Clostridium spp. isolati da campioni di digiuno ed ileo di 82 tacchini provenienti da 17 allevamenti. Gli uccelli, sia maschi che femmine, avevano un’età compresa tra i 6 e i 104 giorni ed avevano problemi enterici. E’ stata ricercata la presenza della tossina NetB. Sono inoltre state effettuate Multiplex PCR per rilevare la presenza dei geni tossigeni cpa, cpb1, cpetx, cp1, cpb2 and cpe. Non sono state riscontrate lesioni ascrivibili ad enterite necrotica. Clostridium perfringens tipo A è stato isolato da 25 campioni enterici, Clostridium difficile è stato isolato in 4 casi e Clostridium sordelli in 1 caso. Clostridium perfringens era presente dai 6 ai 104 giorni di età indicando un suo possible ruolo nei problemi enterici del tacchino.
Non è stata riscontrata la presenza della tossina NetB. Tre dei 4 isolati di Clostridium difficile erano caratterizzati dalla presenza di geni tossigeni.
18 Settembre 2009
2009 – INVESTIGATIONS OF SOME PARAMETERS OF NATURAL IMMUNITY IN MEAT TURKEYS REARED OUTDOORS
Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare l’andamento nel tempo della concentrazione ematica di alcuni parametri di immunità naturale in tacchini da carne, allevati all’aperto. I valori del complemento emolitico, risultati più bassi di quelli evidenziati nel corso di una precedente ricerca in tacchini commerciali e in tacchini mantenuti in ambiente controllato, possono essere giustificati dalle condizioni meteorologiche che potrebbero influire anche in maniera consistente in ibridi “spinti” geneticamente, allevati all’aperto.
18 Settembre 2009
2009 – DIFFUSIONE DI CEPPI DI CLOSTRIDIUM PERFRINGENS NETB POSITIVI IN POLLI SANI ED AFFETTI DA ENTERITE.
La tossina α prodotta dai ceppi di Clostridium perfringenes (CP) è stata considerata per anni come il principale fattore di virulenza dell’enterite necrotica (EN) ma la recente scoperta della tossina NetB ha indotto a riconsiderare l’eziopatogenesi di questa patologia. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare la presenza del gene NetB in ceppi di campo di CP isolati da animali sani ed affetti da enterite. A tale scopo 107 ceppi di CP sono stati tossinotipizzati ed è stata valutata la presenza dei geni codificanti le tossine β2, NetB ed enterotossina. 30 di questi ceppi sono stati isolati da polli affetti da EN, 54 da animali affetti da patologie enteriche diverse dalla EN e 22 da animali sani.
Tutti i ceppi sono risultati di tossinotipo A ed il 26,2% di questi era anche positivo per il gene cpb2 (tossina β2). Nessun ceppo è risultato positivo per la presenza del gene codificante l’enterotossina (cpe). Il gene NetB è stato rilevato nel 27,1% dei ceppi in esame e il 93,1% di questi ceppi postivi era stato isolato da animali affetti da EN. L ’analisi statistica dei dati ha messo in evidenza che il numero di ceppi NetB postivi è più alto negli animali affetti da EN rispetto agli animali sani (53,3% verso 16,7%, p=0,014); tuttavia, l’isolamento di ceppi positivi a NetB anche da animali sani suggerisce che nell’eziopatogenesi dell’enterite necrotica sono coinvolti anche altri fattori di virulenza.
18 Settembre 2009
2009 – MICROBIOLOGICAL CHARACTERISTICS OF POULTRY MEATS-RESULTS OF INSPECTIONS CARRIED OUT IN THE PROVINCE OF MILAN
Sono stati esaminati, sotto il profilo microbiologico quali/quantitativo (C.B.T., Coliformi, E. coli, S. aureus, Clostridi solfito-riduttori, B. cereus, Salmonella spp. e Lysteria spp. e Campylobacter spp.), 240 campioni di carni avicole (pollo, tacchino e quaglia) conferite ufficialmente in base alle norme previste dal Piano regionale di programmazione e coordinamento degli interventi in materia di controllo ufficiale dei prodotti di origine animale della Lombardia e da alcune aziende private per autocontrollo. La CBT è risultata sempre bassa ed in linea con quanto riportato in bibliografia così come è avvenuto anche per i coliformi, E. coli, S. aureus , Clostridi solfito riduttori e B. cereus. Per quanto riguarda Salmonella spp., solo 5 campioni sono risultati positivi: uno a S. typhimurium e uno a S. enteritidis (pollo), un solo campione di tacchino è risultato positivo a S. blokley e due di quaglia su cinque campioni analizzati sono risultati positivi a S. typhimurium. Circa il 3% dei campioni analizzati è risultato positivo a Listeria monocitogenes ma entro i limiti di legge. La ricerca dei Campylobacter termofili ha interessato solo 50 campioni e solo 5 sono risultati positivi. Questi risultati confermano l’elevata qualità igienico-sanitaria delle carni avicole, in accordo a quanto riportato nella bibliografia nazionale e nel rispetto delle norme comunitarie.
18 Settembre 2009
2009 – GENI DI VIRULENZA IN AVIAN PATHOGENIC ESCHERICHIA COLI NEL TACCHINO
In questa ricerca, 50 stipiti di E. coli isolati da tacchini affetti da colibacillosi (APEC) e 15 E. coli provenienti dal contenuto intestinale di soggetti sani (AFEC) sono stati caratterizzati e sottoposti alla ricerca di 8 differenti geni di virulenza. Gli stipiti APEC sono inoltre stati sierotipizzati al fine di evidenziare i sierotipi più frequentemente associati alla malattia. Tra questi, O78 è risultato il sierotipo di gran lunga prevalente. I geni di patogenicità ricercati sono risultati fortemente associati agli stipiti patogeni rispetto a E. coli di origine fecale. Considerando il sierotipo di appartenenza, la totalità di O78 testati presentava i geni legati ai sistemi di acquisizione del ferro ed una elevata percentuale risultava tsh e cva/cvi positiva, confermando il potenziale ruolo di tali geni nella patogenicità di tali sierotipi. Il riscontro tuttavia di uno stipite non tipizzabile sierologicamente e munito di tutti gli 8 geni di virulenza ricercati pone l’attenzione sull’importanza di effettuare una completa e accurata caratterizzazione dell’isolato per poterne valutare l’effettivo potenziale patogeno.
18 Settembre 2009
2009 – OUTBREAK OF PSEUDOTUBERCULOSIS IN COMMERCIAL GUINEA FOWLS (NUMIDA MELEAGRIS)
Focolaio di pseudotubercolosi in faraone (Numida meleagris) d’allevamento
Il presente lavoro descrive un episodio di mortalità riconducibile ad una sindrome setticemica osservata in un gruppo di faraone da carne prossime alla macellazione. L ’esame batteriologico ha permesso di isolare Yersinia pseudotuberculosis dai fegati e dalle milze di tutti i soggetti sottoposti ad autopsia. T ale microrganismo, che è stato isolato da ruminanti domestici e selvatici, suini, mammiferi ospiti di giardini zoologici e lagomorfi, sembra trovare nei roditori e negli uccelli selvatici il suo serbatoio naturale. In letteratura vi sono segnalazioni in volatili ornamentali di casi di pseudotubercolosi sia sporadici che epidemici e, tra le specie domestiche allevate intensivamente, sono segnalati focolai epidemici nel tacchino. Tuttavia non risulta alcuna segnalazione della malattia nella faraona. In considerazione del ruolo di serbatoio svolto da roditori e uccelli selvatici, i volatili d’allevamento, in particolar modo quelli che usufruiscono di parchetti esterni, sono potenzialmente esposti al rischio di infezione da Y. pseudotuberculosis.
Pertanto in presenza di forme setticemiche, soprattutto caratterizzate da epatite necrotica, sarebbe opportuno porre in diagnosi differenziale anche la pseudotubercolosi.
