Riemerella anatipestifer (RA) (precedentemente nota come Pasteurella anatipestifer), è un cocco-bacillo Gram negativo, immobile, catalasi e ossidasi positivo, appartenente alla famiglia delle Flavobacteriaceae e al genere Riemerealla, che comprende solo altre due specie: Riemerella columbina e Riemerella columbipharingys, isolate solo da specie aviarie (Vancanneyt et al. 1999; Rubbenstroth et al., 2013). La prima segnalazione di tale microrganismo risale all’inizio del secolo scorso, associata primariamente ad una polisierosite degli anatidi (Riemer, 1904). Oggi la malattia è da considerarsi cosmopolita anche se il maggiore numero di segnalazioni proviene dal continente asiatico su anatidi.

In Italia la malattia è stata descritta per la prima volta nel 1979 in tacchini da carne di 70 giorni, e in polli da carne di 40-50 giorni (Pascucci et al, 1981). La sintomatologia nel tacchino era caratterizzata da paralisi delle ali e delle gambe, opistotono, torcicollo, ribaltamento, cecità e mortalità del 20%. Nel pollo la sintomatologia era inizialmente respiratoria, subito seguita da forma neurologica con tremori, movimenti scoordinati del capo e tassi di mortalità compresi tra il 3% e il 5%.  Successivamente sono stati osservati anche quadri di zoppia dovuti a localizzazione articolare del patogeno e conseguente artrite (Giovannetti e Pascucci, 1983). Nell’ultimo decennio si è assistito a delle ondate epidemiche che hanno avuto il loro apice nel 2015, anno in cui si è ricorso anche a immunizzazione massiva di gruppi di tacchini con vaccini stabulogeni. La sierotipizzazione di RA ha subito diverse rivisitazioni negli anni passando dall’assegnazione di lettere a quella di numeri. Attualmente sono noti 21 sierotipi di RA, anche se non c’è accordo nel mondo scientifico sui ceppi di referenza che rappresentano ciascun sierotipo. Il primo studio di sierotipizzazione condotto su 75 ceppi italiani isolati dal 79 all’89, aveva evidenziato la circolazione prevalente del sierotipo 1 (ex. “A”), ma erano stati rilevati anche dei ceppi non tipizzabili con il panel di sieri allora a disposizione (sierotipi USA 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, B) (Pascucci et al. 1990).

Successivamente, studi di genotipizzazione hanno mostrato che 2 ceppi di referenza appartenenti al sierotipo “4” in realtà non erano RA ma W autersiella falsenii (Christensen e Bisgaard, 2009). L’esistenza di tale sierotipo appare pertanto messa in discussione.

Sono state impiegate diverse metodiche per la caratterizzazione molecolare dei ceppi: rep-PCR (ripetitive extragenic palindromic sequence polymerase chain reaction), ERIC-PCR (Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus Polymerase Chain Reaction) (Y u et al. 2008), RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) del gene 16s rRNA o del gene OmpA (Subranmaniam et al. 1997), analisi con endonucleasi Hinfl (Rimler e Nordholm, 1998), MLST (Multi Locus Sequence Typing) e PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) con enzima di restrizione SmaI (Y u et al. 2008). La caratterizzazione genetica dei ceppi di RA è uno strumento indispensabile per cercare di comprendere l’epidemiologia della malattia e suggerire delle azioni profilattiche negli allevamenti da reddito. Con il presente lavoro sono state studiate le caratteristiche genotipiche e alcune caratteristiche fenotipiche (sierotipo) di ceppi di RA circolati in Italia, dal 2012 al 2018.

L’uso indiscriminato di antibiotici nel pollame ha contribuito al progressivo aumento della resistenza batterica alle principali classi di antibiotici quali chinoloni, tetracicline e beta-lattamici (Van Den Bogaard et al., 2000; Hricovà et al., 2017). Inoltre, la continua esposizione dei batteri a una grande varietà di  β-lattamici ha causato la mutazione delle β-lattamasi batteriche, responsabile dello sviluppo di resistenze anche nei confronti di β-lattamici di nuova generazione. Questi enzimi sono noti come β-lattamasi a spettro esteso (ESBL). Escherichia coli è una delle specie batteriche in cui la selezione dei geni di resistenza è avvenuta più rapidamente negli anni a seguito dell’uso diffuso e improprio di antimicrobici (Tadesse et al., 2012). I geni responsabili della resistenza sono spesso localizzati in elementi genetici trasferibili come plasmidi e integroni (Ahmed et al., 2013; Cavicchio et al., 2015) e gli E. coli patogeni e commensali possono facilmente ricevere geni di resistenza antimicrobica e trasmetterli ad altri batteri del microbiota intestinale anche per coniugazione (Carattoli et al., 2008;  Laxminarayan et al., 2013). In questo scenario, polli e tacchini commerciali sono considerati un importante serbatoio di isolati multiresistenti di E. coli ed E.coli ESBL per l’uomo (Falgenhauer et al., 2019). Per garantire al consumatore una maggiore sicurezza alimentare, numerose aziende avicole si sono rivolte a linee di prodotti ottenute da allevamenti antibiotic- free e biologici ottenuti senza o limitando l’uso  di antibiotici. In alternativa all’impiego degli antimicrobici attualmente  il controllo delle malattie in campo avicolo, soprattutto per E. coli,  si  basa in prevalenza sulla qualità dell’ambiente e del management  e sull’utilizzo di prodotti alternativi quali prebiotici , probiotici e vaccini autogeni (Fanatico et al., 2009; Diaz-Sanchez et al., 2015;  Koutsianos et al., 2020). L’azione  esercitata dal sistema di allevamento, nel controllo dei batteri resistenti agli antibiotici nelle carcasse di pollo (Cui et al., 2005; Miranda et al., 2008), presenta spesso  aspetti contraddittori. Da studi condotti da Kim et al. (2018) è emerso che nel caso di Enterococcus spp. i tassi di contaminazione batterica erano inferiori nelle carcasse di pollo biologico rispetto alle carcasse di pollo ottenuto da allevamenti convenzionali, così come il livello di resistenza a determinati antibiotici e la presenza di ceppi multiresistenti. Al contrario, Parker et al. (2016) hanno dimostrato  la presenza di Salmonelle  ESBL in prodotti a base di carne di pollo ottenuti da allevamenti antibiotic-free ed inoltre  la mancanza di differenze tra i loro geni ESBL e quelli di Salmonelle isolate da prodotti a base di carne di pollo allevato tradizionalmente. L’obbiettivo di questo lavoro è stato quello di contribuire a definire il ruolo giocato da diverse tipologie di allevamento (convenzionale, biologico e antibiotic-free) nell’influenzare  la suscettibilità antimicrobica dei ceppi di E. coli e la diffusione di E. coli ESBL, in campioni prelevati al macello da soggetti  all’arrivo e alla macellazione.

La coccidiosi è una delle più comuni ed economicamente più importanti patologie del settore avicolo, causata da protozoi appartenenti al genere Eimeria, Tale patologia intestinale è caratterizzata da una forte riduzione delle performance di crescita degli animali con un impatto economico stimato in 25-3 miliardi di dollari di perdite ogni anno. Inoltre, il danno alla mucosa intestinale causato da Einleria spp è considerato il principale fattore predisponente dell’enterite necrotica causata da C. perfringens, largamente ritenuta una delle principali minacce per l’industria avicola globale (Quiroz-Castaneda & Dantan-Gonzalez, 2015; Timbermont et al. , 2011).

Una corretta gestione dell’allevamento è fondamentale per il controllo della patologia, ma data la sua frequenza e la sua diffusione sono necessari una prevenzione ed un controllo di tipo farmacologico. Tali trattamenti prevedono l’utilizzo, sotto regolamentazione, di farmaci anticoccidici (coccidiostatici), solitamente alternati a programmi di vaccinazione nei periodi estivi (Quiroz-Castaneda & Dantan-Gonzalez, 2015).

In particolare in Europa, l’intento è quello di cessare gradualmente l’utilizzo di coccidiostatici, per cui è di grande interesse lo sviluppo di prodotti alternativi da introdurre anche attraverso la dieta dell ‘animale. Lo studio della coccidiosi si basa principalmente su studi in vivo con animali sottoposti a challenge con Einleria, mentre gli studi in vitro sono pochi a causa di una difficile standardizzazione del protocollo. Inoltre, per recuperare le oocisti da cui partire per eseguire la fase in vitro, solitamente viene utilizzato l’animale come incubatore. Dato l’interesse nello sviluppare nuove sostanze anticoccidiche e in accordo con i principi delle “3R” (Replacement, Reduction, Refinement), secondo cui i metodi alternativi in vitro sono da preferire, è opportuno elaborare un metodo in vitro che possa permettere test di screening di molecole bioattive per valutarne le proprietà anticoccidiche.

L’obiettivo di questo studio è l’elaborazione di un protocollo di recupero di oocisti di Eimeria da campioni di campo e la riproduzione dell’infestazione in vitro su un modello cellulare.

La Bronchite infettiva (IB) è una patologia endemica ed estremamente diffusa nell’allevamento avicolo, specialmente se intensivo. Negli allevamenti positivi, anche se gestiti in maniera ottimale, è stata stimata una perdita di produttività del 3% rispetto ad allevamenti negativi (McMartin, 1993). Le caratteristiche del virus della bronchite infettiva (IBV) si riflettono nelle varie problematiche di questo patogeno come l’elevata morbilità, la grande efficienza di tras,missione, l’ampia variabilità genetica, le difficoltà diagnostiche, la scarsa cross-protezione tra i diversi ceppi e la conseguente difficoltà nell’individuare dei vaccini efficaci (Jordan, 2017). Di conseguenza, anche l’epidemiologia della Bronchite infettiva risulta inevitabilmente intricata, influenzata da numerosi fattori e condiziona a sua volta la scelta delle strategie di controllo e la loro efficacia.

La circolazione di IBV sul territorio italiano è stata ampiamente descritta, in risposta alla necessità di contenere il problema In una delle maggiori realtà produttive europee (60 paese per produzione di carne, 30 di uova) (https://ec.europa.eu/agriculture/), riportando uno scenario caratterizzato dall’identificazione di ceppi vaccinali Mass-like e 793B-like (Franzo et al., 2014) e di ceppi di campo QI (Franzo et al., 2018) e QX (Franzo et al., 2017), tra i più rilevanti, con differenti prevalenze nel tempo. L’importanza della conoscenza dell ‘epidemiologia locale è stata più volte messa in luce, in relazione all’interpretazione sia dell’effettivo ruolo di alcuni ceppi, come nel caso del 793B la cui frequenza si è drasticamente ridotta a seguito della sospensione dell ‘utilizzo di vaccini 793B-derived (Franzo et al. , 2014), sia dell’influenza della vaccinazione sulla dimensione della popolazione virale e degli outbreak clinici, come evidenziato per il QX (Franzo et al. , 2016).

In questo contesto si inserisce il presente lavoro che ha avuto come obiettivo l’analisi di ulteriori elementi che possono condizionare l’epidemiologia di IBV, descrivendo per la prima volta l’effetto filiera sulla variabilità e la circolazione di ceppi QX, confrontando la popolazione e i flussi virali di due situazioni produttive separate.

Gli uccelli selvatici rappresentano spesso il serbatoio naturale di patogeni di diversa natura. II motivo risiede sicuramente nella grandissima varietà di specie conosciute, ma soprattutto nelle loro caratteristiche etologiche. La capacità di percorrere lunghe tratte migratorie e la formazione di grandi assembramenti durante gli spostamenti e nelle zone di sosta, permette la veloce diffusione e trasmissione di agenti patogeni sia a livello intraspecifico che interspecifico, anche in vaste aree geografiche. In queste caratteristiche risiede l’importanza del monitoraggio sanitario di tali specie, soprattutto in un’ottica di prevenzione riguardo all’introduzione di patologie potenzialmente zoonosiche e dannose per I ‘attività zootecnica avicola (Milek et al. 2018).

Sicuramente per quest’ultima I ‘esempio più eclatante è rappresentato dall ‘influenza aviare, ma negli ultimi anni si è posta una maggiore attenzione anche ad altri agenti virali in grado di provocare ingenti perdite economiche negli allevamenti. E’ il caso dei virus appartenenti alla famiglia Coronaviridae, tra i quali riveste particolare importanza il virus della bronchite infettiva (IBV). Al momento i coronavirus sono distinti in 4 generi: Alphacoronavirus, Betacoronavirus, Gammacoronavirus e il recente Deltacoronavirus (Chu et al, 2011). I primi due generi sono riferibili ai mammiferi, mentre Gamma e Deltacoronavirus risultano spesso associati agli uccelli, che ne rappresentano il maggiore serbatoio, ma sono inoltre stati identificati in alcuni mammiferi marini e carnivori e nei suini in Asia (Dong et al, 2008; Mihindukulasuriya et al, 2008; McCluskey et al, 2016). Sono virus caratterizzati da un elevato tasso di mutazione e ricombinazione durante le fasi di replicazione, e quindi frequentemente soggetti alla formazione di nuove varianti genotipiche. Tali modifiche, oltre a incidere su virulenza e tropismo, potrebbero permettere ai diversi stipiti di adattarsi più facilmente a nuove specie (Woo et al, 2006). Studi precedenti hanno dimostrato come negli uccelli le infezioni da Gamma e Deltacoronavirus siano generalmente caratterizzate da un andamento asintomatico, permettendo l’insorgenza di alcuni endemismi all ‘interno di determinate popolazioni aviarie (Chu et al, 2011 Gli ordini maggiormente interessati da tale infezione sono Ciconiiformes, Pelecaniformes e Anseriformes, e generalmente si osserva una prevalenza maggiore di Gammacoronavirus. L’infezione da parte di entrambi i generi virali è stata osservata solo negli anseriformi, e, al momento, i dati supportano l’ipotesi che le altre specie possano infettarsi solo con uno dei due generi (Chu et al, 2011).

Scopo del lavoro è rilevare la prevalenza di coronavirus sia nella popolazione di anatidi, sia in specie di uccelli selvatici provenienti da diverse aree geografiche della Lombardia; definire i genotipi circolanti al fine di approfondire il ruolo epidemiologico dell’avifauna nella diffusione di tali virus.

La produzione intensiva di carne di pollo (broiler), è diffusa in tutto il mondo e consiste nel far ingrassare I ‘ammale in capannoni al chiuso, su una lettiera, con temperatura e fotoperiodo controllato, utilizzando mangimi standard. Le tecniche di allevamento spinte ad ottenere la massima produzione di carne, possono favorire l’insorgenza di malattie o in generale la perdita di reddito causata dal cattivo stato di salute degli animali. I patogeni a rischio per la filiera produttiva avicola intensiva sono ben noti e generalmente controllati dalle moderne tecniche di management. Lo studio riporta indagini eseguite in una azienda avicola della Sicilia Orientale a seguito del riscontro di mancato accrescimento nei soggetti in produzione. All’interno di un ciclo di Ingrasso, sono stati identificati dei soggetti che manifestavano crescita ritardata, taglia e peso al di sotto delle performance di razza, inoltre alcuni presentavano difficoltà a deambulare e segm di diarrea. Effettuata la necroscopia, sono state evidenziate lesioni intestinali in tre dei cinque soggetti, quindi sono stati eseguiti campionamenti per ricerca microbiologica, parassitaria, virologica tramite cui è stata identificata la co-infezione da CAstV e ARV mediante Real-Time PCR, mentre I ‘esame istologico ha confermato a vario grado lesioni alla mucosa Intestinale da sub-acuto a cronico; sono presenti anche lesioni a carico del fegato e dei reni.

L’uso eccessivo di molecole antimicrobiche rappresenta ancora una delle principali cause dell’instaurarsi dell ‘antimicrobico resistenza (AMR), responsabile ogni anno di circa 25.000 decessi solo in Europa (Marston et al., 2016).

In base ai dati più recenti, il consumo di antibiotici nel mondo è aumentato del 65% negli anni compresi tra il 2000 e il 2015, raggiungendo i 42 bilioni di dosi definite giornaliere (defined daily doses o DDDs) (Cycofi et al., 2019). In Europa, i principali Paesi consumatori di antibiotici nel 2017 sono stati Spagna, Francia e Cipro, al contrario Italia, Finlandia, Germania, Lussemburgo, Norvegia, Svezia e Regno Unito registrano una riduzione significativa del loro utilizzo (ECDC, 2018).

Il trasferimento orizzontale di geni di resistenza (Antibiotic Resistance Genes o ARGs) è un importante fattore di disseminazione dell’AMR nell ‘ambiente, in grado di portare alla selezione e al mantenimento di batteri multi-resistenti. A questo meccanismo si associa la pressione selettiva esercitata dai residui degli antibiotici che vengono eliminati nelle acque e nel terreno attraverso i reflui fognari e le deiezioni animali, spesso utilizzate come fertilizzanti in agricoltura (Bouki et al., 2013; Daghrir and Drogui, 2013; Wu et al., 2014).

I sistemi di monitoraggio più comuni pervalutare la diffusione di batteri multi-resistenti e dei relativi geni di AMR sono basati sull ‘isolamento di singole specie batteriche a partire da campioni biologici e ambientali e sulle relative prove di antibiogramma.

Tale approccio, oltre a richiedere tempi di esecuzione relativamente lunghi, permette di evidenziare un limitato numero di batteri resistenti, che rappresentano solo una parte del microbiota intestinale e quindi del resistoma, inteso come il complesso degli ARGs che conferiscono AMR ai batteri stessi (Munk et al., 2018).

Al contrario, la ricerca diretta di sequenze specifiche per ARGs mediante prove biomolecolari potrebbe rappresentare uno strumento alternativo di monitoraggio e verifica della presenza di AMR in ambienti ad alta densità microbica come gli allevamenti intensivi. Tale approccio potrebbe aiutare anche ad evidenziare i cambiamenti che possono verificarsi nella composizione del resistoma del tratto intestinale degli animali, in seguito all’applicazione di diverse misure di controllo e profilassi delle infezioni.

Scopo di questo lavoro pertanto è stato di valutare in allevamenti tradizionali di broiler e tacchini del Centro Italia la distribuzione degli ARGs associati alla resistenza nei confronti delle più comuni classi di antibiotici utilizzate nella terapia delle infezioni batteriche.

Le colibacillosi hanno un notevole impatto sull’allevamento avicolo intensivo in tutto il mondo e sono responsabili di perdite economiche rilevanti in tutta la filiera avicola. Esse sono generalmente causate dai cosiddetti Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) [1]. Tra questi, i sierogruppi più frequentemente associati a malattia sono 01, 02, 08, 018, 035, 078, 0109 e OI 15, con gli 01, 02 e 078 che rappresentano 1’80% dei casi [2].

Uno degli aspetti più critici delle colibacillosi aviarie è rappresentato dall’elevata persistenza degli APEC, che possono permanere in allevamento per lunghi periodi, e riemergere anche durante cicli successivi [l]. Le ragioni di tale resistenza non sono ancora del tutto note. Se da una parte sicuramente pesano le caratteristiche intrinseche del batterio, per esempio la capacità di formare biofilm, dall’altra la dispersione orizzontale del germe all’interno del capannone può essere favorita dalla presenza di vettori passivi quali Alphitobius diaperinus e Musca domestica [3, 4, 5].

Non si può escludere però che altri fattori possono intervenire, favorendo la sopravvivenza del germe tra un ciclo e l’altro. Uno di questi potrebbe essere Dermanyssus gallinae. Questo acaro ematofago è diffuso in oltre il 90% degli allevamenti avicoli intensivi [6], esercita un’azione depauperante e stressante sugli animali [7], e può fungere da serbatoio e vettore di diversi patogeni del pollame [8].

Ad oggi le informazioni sulla possibile associazione tra E. coli e D. gallinae sono pressoché assenti, pertanto questo studio si propone di valutare una potenziale relazione tra essi, con particolare attenzione al rapporto che si può instaurare con i sierogruppi patogeni O2 e O78.

II virus della Bursite infettiva (IBDV), agente causale della bursite infettiva aviare (IBD) o malattia di Gumboro, appartiene alla famiglia Birnaviridae, genere Avibirnavirus. Gli IBDV si suddivono in due sierotipi: al sierotipo I appartengono tutti i ceppi patogeni, a loro volta classificati in base a patogenicità e virulenza; al sierotipo 2 appartengono ceppi apatogeni (l).

Tutti i ceppi del sierotipo l, indipendentemente dalla loro patogenicità, causano dei danni alla Borsa di Fabrizio, e immunosoppressione di grado variabile in funzione del ceppo, della presenza d’immunità materna e dell’età del soggetto infettato; le prime 3 settimane di vita rappresentano il periodo più critico.

L’unico modo di prevenire i danni da IBD è la vaccinazione. I vaccini attualmente disponibili sul mercato sono di 3 tipi: vivi attenuati, ad immunocomplessi (vaccino vivo attenuato legato a anticorpi specifici per IBDV), vettori virali (Herpes virus del tacchino – HVT) ingegnerizzati in modo tale da esprimere la proteina di superficie VP2 di IBDV (2).

Alcuni vaccini vivi attenuati possono causare lesioni alla Borsa di Fabrizio simili a quelle indotte dal virus di campo (3), con possibili conseguenze negative sull’immunocompetenza degli animali.

La Bronchite Infettiva (IB) è una patologia respiratoria virale altamente contagiosa diffusa a livello mondiale. IB viene controllata principalmente tramite vaccinazione con vaccini vivi attenuati, ma la risposta a questi vaccini può essere compromessa da stati di immunodeficienza dovuti a patologie virali come IBD Lo scopo di questo lavoro è confrontare la risposta immunitaria a vaccinazione per IB di animali vaccinati per IBD con un vaccino vettorizzato che esprime proteine di superficie di IBDV e del virus della malattia di Newcastle (rHVT-ND-IBD), o con vaccino ad immunocomplessi (Winterfield 2512 IBDv + anti-lBD-antibody).

Chicken Infectious Anaemia Virus (CIAV), agente eziologico dell’anemia infettiva del pollo, è un virus a DNA di piccole dimensioni, 2298 nucleotidi (nt), appartenente alla famiglia Anelloviridae, genere Gyrovirus (Rosario et al., 2017). II genoma è costituito da tre Open Reading Frame che codificano per tre proteine virali denominate: VPI, VP2 e VP3.

VPI è la proteina del capside (Renshaw et al., 1996), con funzioni nella infezione e replicazione virale. Presenta una regione genomica ipervariabile costituita da 13 amminoacidi (aa) situata in posizione 139-151 (Noteborn et al., 1991); importante per la caratterizzazione molecolare dei ceppi (Schat, 2003). Le proteine virali VP2 e VP3 sono non strutturali (Noteborn et al., 1994).

L’infezione da CIAV provoca forma clinica quando avviene, sia per via verticale sia per via orizzontale, nelle prime settimane di vita. II virus determina anemia aplastica e gli animali colpiti presentano depressione, atrofia del timo, del midollo osseo ed emorragie diffuse. Quando l’infezione avviene dopo le 3 settimane di età la malattia si manifesta prevalentemente in forma subclinica, causando una significativa Immunosoppressione. Le cellule target del virus sono gli emocitoblasti nel midollo osseo e i precursori dei linfociti T nel timo (Balamurugan and Kataria, 2006). Ad oggi è conosciuto un unico sierotipo (Yuasa and Imai, 1986), tuttavia, sulla base della sequenza aa della VPI, è possibile distinguere all’analisi filogenetica 3 genotipi di CIAV, denominati I, II e III (Ducatez et al., 2006).

L’obiettivo del presente lavoro è stato quello di caratterizzare dal punto di viste molecolare, ceppi di CIAV circolanti in Italia. Allo scopo è stato messo a punto un protocollo PCR nested per l’amplificazione ed il sequenziamento di una porzione genomica della VPI e le sequenze ottenute sono state impiegate in analisi di sequenza e filogenetica.