Le citochine sono considerati fattori chiave coinvolti nell’induzione della risposta immunitaria e dell’infiammazione; dal punto di vista biochimico sono un gruppo di mediatori in grado di andare ad agire su cellule specifiche e regolare di conseguenza i processi infiammatori e immunitari (Giansanti, Giardi, and Botti 2007). Nei pochi lavori presenti in letteratura in cui è stato indagato il profilo di espressione delle citochine durante lo sviluppo embrionale di pollo (Anastasiadou and Michailidis 2016; Meade et al. 2009), ci si è focalizzati sull’embrione nella fase iniziale dell’embriogenesi (entro i IO giorni di età), analizzando l’embrione in toto. Non ci sono dati, invece, riguardo il profilo di espressione delle citochine nella membrana corion allantoidea (MCA), comparto extraembrionale che per le sue peculiari caratteristiche viene utilizzato come modello per studi di angiogenesi, di farmacocinetica, di tossicologia, oltre che poter ricevere il trapianto di cellule tumorali per studi preclinici di efficacia chemioterapica (Nowak-Sliwinska, Segura, and Iruela-Arispe 2014).

Lo scopo di questo lavoro è stato quello di indagare il profilo di espressione di 5 citochine, 4 di cui pro-infiammatorie (IL-6, IL-I b, IFNa,IFNg) e una antiinfiammatoria (IL-10), a livello di membrana corion allantoidea (MCA) di embrioni Specific Pathogen Free (SPF) di diverse età in modo da verificare lo stato del sistema immunitario innato in un comparto extraembrionale.

Si è poi proceduto con I ‘analisi delle modificazioni dell ‘espressione genica in condizioni di inoculo sperimentale, quali inoculo di soluzione di salina antibiotata sterile (PBS), inoculo del virus della Laringotracheite Infettiva Aviare (LTI) e inoculo di particelle di un virus di origine vegetale, oggetto di studio di un progetto scientifico dell’Istituto Romagnolo per lo Studio e la Cura dei Tumori (IRST) in quanto vettore di proteine potenzialmente oncolitiche. L’inoculazione di questo virus vegetale ha avuto lo scopo di valutare la reazione da parte della membrana corion allantoidea di un potenziale corpo estraneo, incapace di integrarsi all ‘interno delle cellule, ma potenzialmente in grado di stimolare una risposta immunitaria.

La resistenza agli agenti antimicrobici (AMR) negli animali di interesse zootecnico è un problema che riveste una importanza globale in Sanità pubblica. E. coli è conosciuto essere tra le specie batteriche dove più rapidamente, nel corso degli anni , si è verificata la selezione di geni di resistenza a seguito dell’uso di antimicrobici (Tadesse et al., 2012). Tale microrganismo, a causa della sua elevata diffusione , è considerato un indicatore della antibiotico resistenza delle popolazioni di gram negativi e un modello per lo studio di AMR (Kaesbohrer et al. , 2012). Di particolare interesse in tale ambito è il riscontro di isolati di E.coli multiresistenti e ESBL di cui le specie avicole, in particolare pollo e tacchino, sono considerate una importante fonte di contaminazione per l’uomo (De Been et al., 2014; Falgenhauer et al., 2018). L’uso indiscriminato di antibiotici nel settore avicolo ha contribuito infatti a creare l’aumento progressivo di E.coli resistenti alla maggiori classi di antibiotici quali chinoloni, tetracicline e beta lattamici (Van den Bogaard et al., 2000; Hricovà et al. , 2017). I geni responsabili della resistenza sono, inoltre, frequentemente localizzati a carico di elementi genetici trasferibili come plasmidi, pertanto E. coli può facilmente ricevere e trasmettere geni di resistenza antimicrobica ad altri batteri del microbiota intestinale tramite coniugazione (Carattoli et al., 2008 ;Bailey et al., 2010; Laxminarayan et al. , 2013 L’obiettivo di questo lavoro è stato quello di valutare in allevamenti, biologici e antibiotic-free, comuni nel centro Italia , le diffusione di ceppi di E.coli resistenti a diversi antibiotici in base alti e ai temi del campionamento.

Tra le soluzioni per ridurre l’uso di antibiotici nell’alimentazione del pollame, i probiotici rappresentano una valida alternativa in quanto non contribuiscono alla diffusione di geni di resistenza antimicrobica e appartengono a specie microbiche che garantiscono un impiego in sicurezza. Sebbene l’efficacia dei probiotici si basi sul ceppo o sui ceppi selezionati, sulla dose e sulla modalità di applicazione, sulla capacità di rimanere metabolicamente attivi lungo il tratto intestinale, sull’età degli uccelli e sui fattori di stress ambientale, ci sono ancora dibattiti sul livello di interazione che il probiotico può avere con la dieta. II probiotico consumerà alcuni nutrienti dietetici per la propria crescita e la densità energetica della dieta condizionerà anche le performance degli uccelli (Montzouris et al, 2010). nelle galline ovaiole sono disponibili limitate evidenze di questa possibile interazione (Zhang e Kim, 2013; Mikulski et al, 2012). Pertanto, l’obiettivo di questo studio era di determinare l’effetto di un batterio probiotico sulle performance produttive e sulla qualità delle uova nelle galline ovaiole alimentate con diete variabili in termini di densità energetica e di nutrienti.

La malattia di Marek (MD) è una patologia neoplastica a carattere linfoproliferativo del pollo causata dal Gallid alphaherpesvirus 2 (GaHV-2), che determina ingenti perdite economiche nel settore avicolo in tutto il mondo (Schat e Nair, 2013).

Le manifestazioni cliniche della malattia vengono tenute sotto controllo dalla vaccinazione con vaccini vivi attenuati che tuttavia vengono definiti “imperfetti” poiché non sono in grado di prevenire l’infezione (Read et al., 2015). I vaccini impiegati più largamente in Italia sono il ceppo CV1988/Rispens (attenuato a partire da un ceppo di GaHV-2) e l’herpesvirus del tacchino (H V T), appartenente alla specie Meleagrid alphaherpesvirus 1.

Gli ospiti recettivi si infettano tramite inalazione di particelle virali presenti nei detriti delle cellule epiteliali dei follicoli delle penne desquamate contenute nella polvere ambientale (Carrozza et al., 1973); il virus può permanere vitale ed infettante nelle polveri per diversi mesi (Jurajda e Klimes, 1970).

Negli allevamenti di ovaiole e riproduttori pesanti Italiani circolano ceppi ad elevata virulenza in grado di determinare la forma acuta della malattia, caratterizzata da linfomi viscerali (Mescolini et al., 2019b) e di recente sono stati segnalati episodi di MD in allevamenti di broiler nelle forme cutanea, di paralisi transitoria e di “alabama redleg”

Nel presente lavoro sono riportati i risultati di un’indagine epidemiologica sulla circolazione e persistenza ambientale di GaHV-2 in diversi allevamenti di broiler ed in un allevamento di riproduttori pesanti colpito da elevata mortalità attribuibile II virus è stato evidenziato in campioni di polvere ambientale mediante un protocollo di PCR nested, in grado di amplificare il gene meq, principale oncogene di GaHV-2, che nella sua sequenza genomica contiene marker vaccinali e di virulenza.

Mycoplasma gallisepticum (MG) è un patogeno ampiamente diffuso che colpisce numerose specie avicole, può trasmettersi per via orizzontale (contatto diretto, aerosol, polveri, penne) ma la via principale di trasmissione è verticale da animale infetto alla progenie attraverso l’uovo (1). Crea tipicamente un quadro clinico respiratorio con sinusiti ed aerosacculiti con conseguente mortalità, ritardo nella crescita e scarti al macello oltre a mortalità embrionale. E’ dunque un importante capitolo di perdite economiche per l’industria avicola (2). Per far fronte alla problematica sono disponibili sul mercato europeo vaccini vivi attenuati come il 6/85 (Nobilis@ MG 6/85, MSD Animal Health) o il ts-11 (Vaxsafe@ MG, Bioproperties Pty Ltd.). Risulta utile in ambito epidemiologico e di sorveglianza sanitaria poter identificare e correlare i ceppi circolanti con i focolai di infezione ed inoltre poter differenziare i ceppi wild da quelli vaccinali. Differenti metodi molecolari sono stati messi a punto per identificare i ceppi (3,4,5), e quelli che risultano di maggiore interesse sono basati sul sequenziamento di particolari regioni geniche (gene targeted sequencing: GTS), come mgc2 (CDS MGA_0932) (6) e 16S-23S rRNA-IGSR (7) ma non consentono una standardizzazione elevata dei dati ottenuti. Tra i metodi di genotipizzazione basati su sequenza con alto potere discriminatorio e sicuramente standardizzabile troviamo la metodica MLST (multi locus sequence typing), che si basa sull’analisi di mutazioni nella sequenza di un set scelto di geni housekeeping. Brevemente, ad ogni differente gene con specifiche mutazioni viene assegnato un numero che definisce un allele del gene stesso, la sequenza di alleli assegnati al set di geni creano un “sequence type” numerico (ST) univoco che identifica il ceppo di MG analizzato. Scopo di questo studio è stato quello di valutare la metodica MLST applicata a Mycoplasma gallisepticum e pubblicata recentemente (8) su campioni conferiti all’Istituto Zooprofilattico delle Venezie (IZSVe) dal 2010 con differente provenienza geografica (bacino mediterraneo) e sottoposti ad isolamento e tipizzazione mediante analisi di sequenza del gene mgc2 (9). Contestualmente è stata valutata la stabilità genetica che questa metodica riesce a rivelare nel tempo impiegando un ceppo dopo vari passaggi in coltura.

L’enterite emorragica (HE) è una malattia virale del tacchino che colpisce soggetti a partire dalla quarta settimana di vita. In animali sensibili, la patologia è caratterizzata da depressione, morte improvvisa e feci sanguinolente ed è associata ad immunosoppressione. L’importanza economica di questa malattia è dovuta alla mortalità da essa provocata, che può raggiungere anche il 60%, ed alla presenza di una immunodepressione transitoria che può favorire l’insorgenza di altre patologie (Saunders et al., 1993). Studi di campo evidenziano che la malattia si manifesta più frequentemente in soggetti di 7-9 settimane di età (Fadly e Nezerian, 1982). Negli ultimi anni si riscontra principalmente la malattia in forma subclinica associata a mortalità per I ‘insorgenza di infezioni batteriche secondarie (Giovanardi et al., 2014). L’agente eziologico dell’enterite emorragica è Turkey siadenovirus A (genere Siadenovirus, famiglia Adenoviridae) virus a DNA lineare a doppio filamento, comunemente denominato Turkey Ilemorragic Enteritis Virus (THEV). Recentemente per il controllo dell’Enterite Emorragica del tacchino è stato introdotto in Italia, con permesso di importazione temporaneo, un vaccino vivo attenuato ceppo Domermuth. II presente lavoro è nato con l’obiettivo di monitorare la presenza di THEV mediante studi longitudinali in sette gruppi di tacchini vaccinati per T HEV a quattro settimane di età con vaccino vivo (5 gruppi) o inattivato (2 gruppi). Tamponi cloacali sono stati eseguiti settimanalmente e processati per la caratterizzazione molecolare dei ceppi virali rilevati.

II virus della bronchite infettiva (IBV), responsabile di diverse forme cliniche raggruppate sotto il nome di bronchite infettiva (BI), rappresenta una delle minacce di maggior rilevanza sia sanitaria che economica per l’avicoltura mondiale. Essendo un virus a ssRNA+, IBV è caratterizzato da una notevole variabilità genetica, la quale determina la continua comparsa di nuove varianti tra cui esistono differenze in termini di tropismo, patogenicità, localizzazione geografica e nel livello di cross-protezione garantito nei confronti di altri ceppi (Valastro et al. , 2016).

Nonostante i vaccini vivi attenuati, che rappresentano uno strumento essenziale per un efficace controllo della sintomatologia, siano utilizzati routinariamente negli allevamenti intensivi, il loro utilizzo non è esente da svantaggi. Ceppi di origini vaccinale possono diffondersi a popolazioni non vaccinate, oltre a poter andare sporadicamente incontro a fenomeni di rivirulentazione o di ricombinazione con ceppi di campo (Jackwood and Lee, 2017; Moreno et al., 2017). La pressione immunologica determinata dalla vaccinazione sembra inoltre contribuire all ‘incremento del tasso di mutazione di IBV (Jackwood et al., 2012). Ciononostante, I ‘impatto che essi hanno sull ‘epidemiologia di IBV viene scarsamente tenuto in considerazione.

Per valutare come cambiamenti nelle strategie vaccinali possano modificare l’epidemiologia molecolare di IBV, uno studio retrospettivo è stato condotto su campioni prelevati nell’arco di sette anni in allevamenti di broiler appartenenti ad un’unica filiera produttiva, oggetto nel 2015 di una modifica nel piano vaccinale nei confronti di IBV.

II virus A/HIN Ipdm(09) è stato descritto per la prima volta nell’uomo in Messico e da allora, oltre che nella popolazione umana, è stato isolato a livello globale nel settore suinicolo ed avicolo. Tra le specie avicole allevate, la categoria produttiva colpita è stata sempre quella del tacchino da riproduzione e specificatamente le femmine mature, con marcato ed improvviso calo della ovideposizione (Egg Drop) in assenza di mortalità anomala o di altra sintomatologia riferibile ad infezione da virus influenzali. Lo studio di filogenesi del virus, a partire da campioni clinici aviari, ha sempre dimostrato una elevata similarità con i ceppi circolanti umani e in alcuni casi una completa omologia con isolati clinici di operatori avicoli sintomatici coinvolti nelle pratiche di inseminazione artificiale (IA), suggerendo quindi l’occorrenza di una reverve-zoonosis.

Ne consegue, che l’inseminazione artificiale, prerogativa di questo settore avicolo, rappresenti il più importante determinante nell’instaurarsi dell’infezione nel tacchino da riproduzione e l’ipotesi più plausibile è che le tacchine si infettino durante le pratiche di manipolazione associate all’inseminazione artificiale, attraverso il contatto diretto con secrezioni infette umane o con attrezzature contaminate dalle stesse. Le infezioni sperimentali in tacchini di diverse età e attraverso diverse vie di inoculo hanno individuato nella via intrauterina la modalità di infezione primaria responsabile dell’insorgenza di Egg Drop. In tutti i casi descritti in letteratura il calo/blocco dell’ovideposizione ha presentato un andamento autolimitante con ritorno in pochi giorni alla deposizione ma con performance produttive ridotte rispetto allo standard.

Lo scopo del presente lavoro è quello di riportare i risultati di approfondimenti diagnostici effettuati dopo la prima conferma di laboratorio di infezione da A/HINlpdm(09) in tacchine da riproduzione associato a drastico ed improvviso calo dell’ovideposizione e all ‘evidenza di infezione e shedding virale anche nei maschi riproduttori dell’azienda.

La colibacillosi, l’enterite necrotica e la spondilite enterococcica, anche detta condronecrosi con osteomielite batterica (BCO), sono tre patologie Che causano importanti riduzioni delle performance di crescita e notevoli perdite economiche nelPallevamento avicolo. La colibacillosi trasmessa da ceppi patogeni aviari di Escherichia coli (APEC) Ia principale causa di morbilitå e mortalitå nel pollo (1). Sebbene esistano diversi patotipi, tra cui alcune forme extraintestinali, la forma piü comune quella intestinale (2). Gli animali infetti si mostrano letargici, possono

essere soggetti a problemi respiratori e, nei casi piü gravi, ad episodi diarroici debilitanti (3).

L’enterite necrotica, causata da Clostridium perfringens e spesso associata a problemi di coccidiosi in allevamento, è caratterizzata da necrosi ed infiammazione del tratto gastrointestinale. La forma subclinica è la più critica per l’industria avicola, determinando un alto tasso di mortalità e drastici cali di produttività (4).

Entemcoccus cecorum è un componente del microbiota intestinale di diversi mammiferi e volatili. È stato recentemente riconosciuto come patogeno emergente a livello globale ed agente eziologico della BC() (5), provocando necrosi del tessuto cartilagineo ed infiammazione di osso e midollo osseo in diversi siti di lesione suscettibili al rapido accrescimento che contraddistingue i polli da carne, tra cui la vertebra T4 e la testa di femore e tibia. Sebbene la patogenesi non sia ancora chiara, si ipotizza che ceppi patogeni traslochino dall ‘intestino al circolo sanguigno, raggiungendo i siti di lesione sopracitati e colonizzandoli (6, 7).

Diverse sono le resistenze ad antibiotici convenzionali riportate in letteratura per quanto riguarda queste specie batteriche. L’antibiotico-resistenza è un tema di rilevanza globale, attualmente critico anche nell’ambito dell ‘allevamento avicolo.

Ad oggi è essenziale ricercare molecole, alternative o adiuvanti l’azione degli antibiotici, al fine di evitare un ulteriore declino nell’efficacia dell’azione di questi farmaci: una soluzione a questo problema potrebbe essere I ‘utilizzo di acidi organici (OA) e composti naturali identici (NIC) in sostituzione o in associazione agli antibiotici.

La Bronchite infettiva (BI) è una malattia infettiva di primaria importanza per l’avicoltura, essendo responsabile di rilevanti perdite economiche a livello mondiale.

L’agente eziologico, avian infectious bronchitis virus (IBV) è un membro della specie Avian coronavirus, genere Gammacoronavirus, famiglia Coronaviridae.

Come gli altri membri della famiglia, si caratterizza per una grande variabilità antigenica e fenotipica, conseguente all’alto tasso di mutazione e di ricombinazione. Le conseguenze di questa variabilità sono particolarmente evidenti nel caso dello Spike virale (ed in particolare della sub-unità SI), proteina strutturale implicata nel tropismo cellulare, nel legame recettoriale e nell’induzione dell’immunità cellulare e umorale neutralizzante (Jackwood et al. , 2012). La grande variabilità genetica dell ‘SI è stata inoltre sfruttata per la classificazione di IBV in genotipi e lineage, i quali possono differire significativamente per proprietà biologiche, immunologiche e distribuzione geografica (Valastro et al., 2016).

Le implicazioni per il controllo della malattia sono oramai ben note. Attualmente, il controllo della malattia si basa in massima parte sull’uso della vaccinazione. Tuttavia, le peculiarità fenotipiche dei diversi genotipi o addirittura di specifici ceppi esitano frequentemente in fenomeni di limitata cross-protezione, richiedendo l’uso di combinazioni di vaccini al fine di aumentare lo spettro di protezione e lo sviluppo di nuovi vaccini, per fronteggiare l’emergenza o l’introduzione di nuovi genotipi (Cook et al. , 1999).

Sebbene questo scenario sia ampiamente assodato, le reali forze implicate nell’evoluzione di IBV sono tuttora poco conosciute. Infatti, un elevato tasso di mutazione o ricombinazione non si traduce automaticamente in un’elevata variabilità biologica: acciocché nuove varianti fenotipiche possano persistere e diffondersi queste devono essere favorevolmente selezionate dall’ambiente. E facilmente intuibile come l’immunità dell’ospite, sia essa naturale o di origine vaccinale, possa rappresentare uno dei maggiori fattori in grado di condizionare l’evoluzione virale. Nel caso di IBV sembrano sussistere diverse condizioni affinché l’immunità vaccinale possa condizionare l’evoluzione virale, selezionando specifici ceppi e favorendo l’emergere di nuove varianti. L’applicazione massiva e precoce della vaccinazione e l’elevato turn-over degli animali determinano la replicazione e l’evoluzione virale in un “ambiente” condizionato essenzialmente dall’immunità vaccinale, piuttosto che da quella naturale La protezione solo parziale indotta dai vaccini attualmente disponibili permette con una certa frequenza la circolazione, anche prolungata, di ceppi di campo in allevamenti vaccinati e potrebbe ulteriormente favorire la selezione di vaccine-escape variants. Sebbene teoricamente plausibili, conferme sperimentali a supporto di tale ipotesi nel caso di IBV sono, ad oggi, mancanti (Read and Mackinnon, 2010).

II presente lavoro si propone di studiare l’impatto della vaccinazione sull’evoluzione dei ceppi di campo del genotipo QX (lineage GI-19), beneficiando del particolare scenario determinatosi in Italia. Un radicale cambiamento nelle strategie di controllo ha infatti interessato una parte rilevante delle aziende del Nord Italia, permettendo di dividere chiaramente il periodo dello studio in una fase precedente e successiva all’introduzione della vaccinazione omologa nei confronti di questo genotipo(Franzo et al., 2016).